奧林巴斯顯微鏡：DIC顯微鏡的基本概念

活細(xì)胞等透明，未染色的標(biāo)本往往是難以觀察到，在傳統(tǒng)的明照明下使用全孔徑和分辨率的顯微鏡的物鏡和聚光系統(tǒng)。，首先在20世紀(jì)30年代開發(fā)的釉澤尼克相襯，經(jīng)常使用這些具有挑戰(zhàn)性的標(biāo)本圖像，但該技術(shù)受到暈文物，被限制到非常薄的樣品準(zhǔn)備，不能利用充分聚光鏡和物鏡孔。

基本差干涉對(duì)比（DIC）的系統(tǒng)，在1955年首次由Francis史密斯設(shè)計(jì)，兩個(gè)渥拉斯頓棱鏡附加的，一個(gè)聚光鏡的前焦平面的變形的偏振光顯微鏡物鏡的后焦平面的第二上面的（參見圖1）。幾年后，喬治諾馬斯基，波蘭出生的法國(guó)物理學(xué)家，修改了標(biāo)準(zhǔn)的的沃拉斯頓棱鏡配置使這些極其薄的光學(xué)元件的物理位置遠(yuǎn)離光圈共軛平面。

微分干涉對(duì)比顯微鏡的光學(xué)元件不掩蓋或以其他方式阻撓的物鏡和聚光鏡孔（如相或霍夫曼調(diào)制對(duì)比），從而使儀器能夠被完整的數(shù)值孔徑。其結(jié)果是分辨率顯著改善（尤其是沿光軸），消除暈文物，并有能力產(chǎn)生極好的圖像比較厚的標(biāo)本。此外，微分干涉對(duì)比產(chǎn)生一個(gè)圖像，可以容易地控制使用的數(shù)字視頻成像技術(shù)，以進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)比度。

圖1中顯示的是典型的微分干涉對(duì)比配置為一體的現(xiàn)代化還配備熒光照明的透射光顯微鏡。基本的光學(xué)計(jì)劃類似于一個(gè)傳統(tǒng)的偏光顯微鏡加裝專門分光棱鏡。甲插入聚光鏡之前和之后的物鏡的光學(xué)路徑的偏振器和分析器。（改性渥拉斯頓或利用Nomarski）幾個(gè)光束分離棱鏡設(shè)計(jì)，以適應(yīng)具有不同的焦距和光圈尺寸的聚光鏡安裝在轉(zhuǎn)臺(tái)組件的物鏡，而一個(gè)單一的利用Nomarski棱鏡（兼容所有物鏡式樣）駐留在一個(gè)滑塊幀定位在物鏡轉(zhuǎn)換器。這些輔助部件的相對(duì)的光的方向和順序定位也表示在圖中。

與相襯，微分干涉對(duì)比標(biāo)本光學(xué)路徑長(zhǎng)度為振幅的差異，可以提高對(duì)比度，可視化產(chǎn)生的圖像轉(zhuǎn)換梯度。的檢體的光程差是由折射率差之間的檢體及其周圍介質(zhì)中，經(jīng)過(guò)的光束的光路上的兩個(gè)點(diǎn)之間的幾何距離（厚度）的商品。微分干涉對(duì)比顯微鏡的圖像有一個(gè)獨(dú)特的影子投外觀，仿佛他們是從一個(gè)非常斜的光源從單一方位照亮。不幸的是，這種效果，往往呈現(xiàn)標(biāo)本中的偽三維浮雕，由不知情的顯微鏡技術(shù)經(jīng)常被認(rèn)為是實(shí)際地形結(jié)構(gòu)的一個(gè)指標(biāo)。

微分干涉對(duì)比顯微鏡不同于傳統(tǒng)的雙光束干涉儀器的情況，在很大程度上是一種定性的而非定量的技術(shù)。標(biāo)本進(jìn)行采樣，由兩個(gè)緊密間隔的部分相干的，但正交的，分隔的波陣面的距離稍稍下方的顯微鏡的橫向分辨率。由于采樣光束和參考光束遍歷試樣類似的區(qū)域（和/或周圍介質(zhì)），該密閉空間的間隔距離小于2微米，DIC，因此無(wú)法產(chǎn)生精確的測(cè)量試樣的折射率或厚度。相反，該技術(shù)可用于確定相梯度方向，并充分利用物鏡光圈超越眼前的焦平面標(biāo)本功能定位的模糊干擾產(chǎn)生薄的光學(xué)部分。

微分干涉對(duì)比中采用的波對(duì)所產(chǎn)生的來(lái)源于鎢燈絲的平面偏振的相干光的波陣面的雙折射分束器（無(wú)論是一個(gè)的渥拉斯頓或利用Nomarski化合物棱鏡）的動(dòng)作的前焦面的顯微鏡聚焦到聚光鏡（分束器的位置）。當(dāng)由分束器產(chǎn)生的一對(duì)相干光遇到相位梯度，由于折射率和/或厚度的變化，將成為變形和每條射線在遍歷試樣時(shí)，遇到一個(gè)稍微不同的光程差。剛剛從檢體時(shí)，光線將是不相等的相位。的光程差是翻譯由DIC顯微鏡目鏡中觀察到在最終圖像中的振幅變化成。然而，從簡(jiǎn)單地檢驗(yàn)圖像，它是不可能的，以確定是否在試樣的相位梯度的折射率或厚度（或兩者）的差異的原因。這種不確定性是由于這樣的事實(shí)：折射率和厚度的產(chǎn)品是來(lái)自于光程差，缺乏任一數(shù)量的獨(dú)立的信息，原產(chǎn)地的差異，不能確定。

光束分離棱鏡的試樣通過(guò)相位梯度所產(chǎn)生的波陣面后，通過(guò)微分干涉復(fù)合第二棱鏡和分析器（另一個(gè)偏振片）的梯度，得到高對(duì)比度的再現(xiàn)。依賴于試樣的采樣光束和參考光束之間的相位差，振幅變化的基礎(chǔ)上產(chǎn)生一個(gè)圖像的兩個(gè)微分干涉對(duì)比，相位相反的。相襯圖像轉(zhuǎn)換從試樣衍射光波和參考光束通過(guò)聚光鏡的環(huán)形帶，試樣和相位板之間表現(xiàn)出的相位變化的振幅信息。DIC圖像的區(qū)別，但是，對(duì)應(yīng)于數(shù)學(xué)的一階導(dǎo)數(shù)的大小，從試樣得到的光程差的梯度分布，而不是。

在DIC的顯微鏡的光路中的梯度和強(qiáng)度分布之間的關(guān)系示于圖2。圖2（a）中提出的標(biāo)本是一個(gè)環(huán)形的人紅細(xì)胞微分干涉對(duì)比與剪切軸由雙箭頭（西北向東南）表示在高放大倍率成像。的光程差（縱軸）的詩(shī)句甲積紅細(xì)胞的直徑沿剪切軸（橫軸）是圖2（b）中所示。需要注意的是光路配置文件反映了薄中心厚邊展出人體紅細(xì)胞?？缥⒎指缮鎸?duì)比度的圖像，非常密切的對(duì)應(yīng)的光程差曲線（圖2（b）），當(dāng)添加到一個(gè)恒定的一階導(dǎo)數(shù)，在圖2（c）的強(qiáng)度掃描。正面和負(fù)面的道中的紅細(xì)胞的光路配置文件生成區(qū)域的較高和較低的幅度，分別在一階導(dǎo)數(shù)的掃描和相應(yīng)的微分干涉相襯圖像。的光程差分布的區(qū)域的，沒(méi)有表現(xiàn)出的斜率變化為背景，以有相同的強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的光程差的一階導(dǎo)數(shù)的積的基線。

微分干涉對(duì)比光學(xué)配置

戰(zhàn)略布局的精確匹配的光學(xué)元件（或）共軛附近的飛機(jī)和其他的特定位置，于顯微鏡微分干涉對(duì)比（參見圖1）的配置方案是必不可少的。所有的主要制造商提供高品質(zhì)，精密DIC的光學(xué)配件，往往在銷售工具包，為他們倒正派研究顯微鏡。在一般情況下，只有四種基本組件都需要配置研究或標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的明視野顯微鏡觀察，微分干涉對(duì)比：

· 線性偏振器 -插入到在顯微鏡光端口（或后的任意位置的照明光源聚光透鏡）和聚光透鏡組件（參見圖1和圖3）之間的光學(xué)路徑中，該組件被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生必要的平面偏振的光干擾的成像。振動(dòng)面的電矢量分量的透射軸被定向在一個(gè)東-西的方向（從右到左，在顯微鏡前站立時(shí)），典型的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的偏光顯微鏡。某些微分干涉對(duì)比設(shè)計(jì)包括一個(gè)旋轉(zhuǎn)偏振器結(jié)合為四分之一波長(zhǎng)的相位差板，在此位置在顯微鏡。同時(shí)，這些組件被稱為一個(gè)去Sénarmont補(bǔ)償，并設(shè)計(jì)用于調(diào)節(jié)圖像的對(duì)比度，如隨后將要討論的，以提供更精確的控制。

· 聚光鏡渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡 -為了分離成兩個(gè)部分偏振光從偏振片發(fā)出的，一個(gè)專門的光束分離棱鏡（通常稱為為聚光鏡棱鏡）被置于聚光鏡光圈光闌孔徑的共軛焦點(diǎn)面或其附近的如在圖3中示出。事件平面偏振光波前分割（或剪切）到相互垂直正交偏振分量（稱為普通和非凡的波前）沃拉斯頓棱鏡諾馬斯基。

· 物鏡利用Nomarski棱鏡 -后面的物鏡位置（圖3），可以在一個(gè)可調(diào)節(jié)的滑動(dòng)框架或固定安裝，第二光束分離棱鏡采用重組剪切的波陣面的共軛面的物鏡后孔徑。此組件，這是至關(guān)重要的干擾和圖像形成的元素，也被稱為物鏡棱鏡。在大多數(shù)情況下，在聚光鏡和物鏡焦平面下棱鏡的設(shè)計(jì)和光學(xué)特性不同，以確保干涉顯微鏡孔徑平面光學(xué)共軛的平面重合。

· 分析儀 -第二線性偏振物鏡棱鏡后面，通常安裝在顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換器之間的中間管和觀察（目鏡）管。稱為一個(gè)分析器，該偏振元件位于前管透鏡（無(wú)限遠(yuǎn)校正的顯微鏡）和圖像平面（圖3）中的光學(xué)路徑。該分析儀的方向（北-南）的電場(chǎng)矢量垂直于的臺(tái)下偏振器的透射軸。圓形和橢圓偏振光，通過(guò)分析儀和隨后到達(dá)從物鏡棱鏡通的組件進(jìn)行干擾產(chǎn)生DIC圖像中間顯微鏡影像平面（目鏡固定膜片或相機(jī)系統(tǒng)投影鏡頭光圈）。

當(dāng)渥拉斯頓和/或利用Nomarski棱鏡從微分干涉顯微鏡的光學(xué)路徑中刪除，光學(xué)配置相當(dāng)于調(diào)整的最大消光（正交偏光）的標(biāo)準(zhǔn)偏振儀器。由于DIC技術(shù)依賴于平面偏振光，雙折射標(biāo)本或緊張光學(xué)元件，可干擾圖像強(qiáng)度，生產(chǎn)未聚焦的明亮區(qū)域，否則暗（或黑色）背景。出于這個(gè)原因，DIC顯微鏡的配置應(yīng)采用無(wú)應(yīng)變的物鏡和（優(yōu)選）聚光透鏡元件。標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡物鏡通常包含應(yīng)力簽名的鏡頭坐騎緊張，閉塞和雙折射的不均勻性，在鏡頭產(chǎn)生的玻璃。這些缺陷往往會(huì)導(dǎo)致降低的對(duì)比度水平，它可以產(chǎn)生嚴(yán)重的后果的最終圖像的保真度。此外，分離的波陣面的接近（略小于衍射限制的分辨率）需要高精度的顯微鏡物鏡的規(guī)格，特別是在大的放大倍數(shù)，為了實(shí)現(xiàn)這種技術(shù)的能力的完整分辨率。

圖3給出了通過(guò)一個(gè)典型的DIC顯微鏡的光學(xué)列車是一種理想化的主要組件和光路的概略圖。透過(guò)偏振片射出的局部區(qū)域的燈絲通形成直線偏振光方向平行的軸線的相干波陣面由相鄰的偏光元件（相對(duì)于45度的頁(yè)面的平面）的雙箭頭所示。渥拉斯頓組合棱鏡位于聚光鏡上的前焦面的偏振波陣面會(huì)聚。

由棱鏡（下面討論），剪切后得到的正交或相互垂直的波陣面被示為一系列的紅色雙箭頭（波前平行于頁(yè)）點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)（波前垂直于頁(yè)面）。一旦他們所走過(guò)的光路梯度標(biāo)本中，波前聚集的物鏡和收斂后焦平面，第二沃拉斯頓棱鏡定位。重組的波陣面，然后穿過(guò)第二偏振器（分析儀），其中偏振元件相對(duì)于子聚光鏡型偏振器（90度）的左側(cè)的黑色雙箭頭所指示的透射軸的方向與。注意聚光鏡棱鏡成像到圖3中的物鏡棱鏡，所以，在每一點(diǎn)上的棱晶（相對(duì)于彼此反轉(zhuǎn)）沿表面相匹配的波前的剪切。翻譯沿剪切軸（垂直于顯微鏡光軸平行于頁(yè)，如下面所討論的）的任一棱鏡產(chǎn)生的波陣面的不匹配是均勻的跨顯微鏡孔徑。

沃拉斯頓和諾馬斯基棱鏡

雙折射的沃拉斯頓和/或諾馬斯基棱鏡插入在光學(xué)通路與剪切軸取向成45度角（西北向東南），偏光器和分析儀。兩個(gè)精密研磨和拋光的板坯生產(chǎn)的高品位的光學(xué)石英，單軸雙折射晶體楔形棱鏡組成的。必須制作兩個(gè)石英楔具有垂直方向的光軸，以產(chǎn)生一個(gè)單一的渥拉斯頓棱鏡（或利用Nomarski）。楔形件上面的斜邊膠合在一起，以產(chǎn)生光學(xué)各向異性的復(fù)合板，其中的第一楔形晶體的光軸垂直于光軸的第二楔形。入射的直線偏振光進(jìn)入棱鏡的偏振光以45度的角度，在與光軸取向在聚光鏡孔徑的波陣面被劃分成兩個(gè)獨(dú)立的正交波，稱為普通和特殊的波。

相互垂直的不尋常和普通的組成部分的波陣面是一致的，在相同的方向上具有相同的幅度（70.7％的原來(lái)的極化波），以及旅游，通過(guò)渥拉斯頓棱鏡的下半部分。然而，波以不同的速度傳播，由介電性能的低雙折射石英結(jié)晶楔的沿慢軸和快軸的定義。普通波通過(guò)棱鏡所得的快軸方向（具有低的折射率），而通過(guò)慢軸，它具有更高的折射率的非尋常光的行進(jìn)。石英，快軸和慢軸之間的折射率差約為0.6％，和快軸的取向垂直于晶軸的楔形。因此，普通的波穿過(guò)石英楔部，而垂直于光軸的方向平行于該軸的異常波。

膠結(jié)石英楔子，剪切角的角度定義為空間上分開的波成為上面的折射率之間的交界處發(fā)生的波陣面的角度分割或剪切。在這個(gè)邊界，普通且平凡的波也交換身份（圖4）。一個(gè)波陣面（普通）從低折射率的介質(zhì)傳播到較高的折射率的第二介質(zhì)（上楔塊）和彎曲朝向的法線（垂直于的楔子光軸的），根據(jù)斯涅耳定律。秒的波陣面（特別）離開高折射率的介質(zhì)進(jìn)入的第二介質(zhì)的折射率低，彎曲的波前相差的正常，但作為第一個(gè)波陣面在相同的角度。

剪切角和分離距離是恒定的整個(gè)面部的棱鏡的所有事件的波陣面，無(wú)論的入口點(diǎn)。波陣面的剪切的方向被定義由棱鏡剪切軸，在于渥拉斯頓棱鏡的平面是平行的光學(xué)軸（晶體學(xué)）的的石英楔部的下（如圖4中所示）。其結(jié)果是，將一個(gè)進(jìn)入Wollaston棱鏡的偏振波陣面的剪切軸方向平行的方向，而另一種是面向垂直于該軸。剪切角是由棱鏡組件的設(shè)計(jì)（石英楔角，不到一定程度的電?。?，并在顯微鏡中無(wú)法調(diào)整。然而，剪切距離為分鐘（通常小于一個(gè)微米），沒(méi)有可觀察到的光束分離發(fā)生在從棱鏡射出。

在旅途中通過(guò)較低的石英楔子在渥拉斯頓棱鏡，普通和特殊的波陣面遇到不同的折射率，如上所討論的。其結(jié)果是，在普通的波陣面通過(guò)比非凡的波陣面的晶體在一個(gè)較高的速度傳播。于石英楔子的下限和上限之間的界面的波陣面的交換身份時(shí)，普通的波陣面的變成非凡的波陣面的，反之亦然。此外，波陣面時(shí)，通過(guò)下部和上部的一半的渥拉斯頓棱鏡的幾何路徑是相同的，經(jīng)過(guò)棱鏡的下半部分中的相移（由于折射率差），在上半部完全補(bǔ)償（圖4 （b）段）。離中心體驗(yàn)的旅程，通過(guò)較長(zhǎng)的下棱鏡楔前被剪（圖4（C）），或上楔形剪切后（圖4（a）），在退出之前穿過(guò)棱鏡的波陣面。由波陣面擴(kuò)展的距離通過(guò)單棱鏡楔最終使波（無(wú)論是普通的（圖4（a）條）或非經(jīng)常性（圖4（c））領(lǐng)先于其他到達(dá)石英空中接口橫向面的棱鏡，每單位長(zhǎng)度的恒定相移發(fā)生在剪切方向上是相等的，但相反的，普通和特殊的波陣面（圖4（a）和圖4（c）），一端非凡的波陣面的棱鏡，提前出現(xiàn)的普通的波陣面，而在相應(yīng)的位置上的另一端，普通的波陣面射出棱鏡之前的非同尋常的波陣面。

如果剪切軸平行的方向上的渥拉斯頓棱鏡的入射偏振光的波陣面，然后正交分裂的波前將不會(huì)發(fā)生，直線偏振光，會(huì)出現(xiàn)從棱鏡。同樣地，如果入射的偏振光的波陣面的方向垂直于棱鏡剪切軸，它也將出現(xiàn)從棱鏡相對(duì)于取向不變。理想的情況下（和所需的微分干涉顯微鏡）發(fā)生時(shí)，入射的偏振光的波陣面以45度的角度的棱鏡的剪切軸的取向。電矢量的直線偏振光進(jìn)入從這個(gè)角度一分為二成兩個(gè)分量矢量，每個(gè)振動(dòng)的快或慢的石英晶體軸線的平面，并具有（70.7％）的根均方原來(lái)的波陣面的振幅。兩個(gè)沃拉斯頓和諾馬斯基的棱鏡表現(xiàn)出定向依賴特性。準(zhǔn)直的線偏振光束，在一個(gè)45度角進(jìn)入對(duì)面的棱鏡，（這次從頂部）也將產(chǎn)生正交平凡和普通的波陣面。然而，極化波將顛倒過(guò)來(lái)。

渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡時(shí)被夾在兩個(gè)交叉的偏振器之間，并檢查與透射光通過(guò)兩個(gè)偏振器，棱鏡，平行與一個(gè)主要的中央的黑色帶（邊緣）（圖5中所示），可以觀察到的干涉條紋的圖案。這些模式的結(jié)果之間的斜高亢的普通且平凡的波陣面棱鏡的臉出現(xiàn)的干擾。的外圍邊緣的左側(cè)和右側(cè)的中央暗干涉條紋，顯示的經(jīng)典偏振干涉色譜的日益增加的訂單。專為物鏡，具有不同的焦距和數(shù)值孔徑棱鏡楔切越來(lái)越淺的角度（放大倍率和數(shù)值孔徑增加）產(chǎn)生較窄的干涉條紋綁扎。圖5為一系列的固定利用Nomarski棱鏡設(shè)計(jì)的連續(xù)的較高的物鏡的放大倍數(shù)（圖中所示）上的右手側(cè)示出這個(gè)概念。

如果一階補(bǔ)償器（紅板）被添加到在對(duì)角位置（圖5中未示出）的交叉偏振器夾心，被替換為黑色條紋表示減法（黃色）在一邊和另外（藍(lán)色的干涉色）原來(lái)的暗條紋的位置的另一側(cè)。添加的第二沃拉斯頓或利用Nomarski棱鏡頂部的第一相移補(bǔ)償（以及由此產(chǎn)生的干涉條紋）的第一棱鏡的整個(gè)長(zhǎng)度上，導(dǎo)致消光（如圖5中所示，注意才能觀察到，這種影響，如果實(shí)驗(yàn)有兩個(gè)棱鏡相同的剪切角）。翻譯棱鏡相對(duì)于其他橫向均勻的偏置，或路徑長(zhǎng)度的變化，將被引入，可以觀察到（圖5）通過(guò)三明治。在一個(gè)方向上滑動(dòng)棱鏡將變暗，然后減輕棱鏡，在另一個(gè)方向上滑動(dòng)的同時(shí)，將產(chǎn)生一系列均勻的干涉色（從黃色一階）。

夾在兩個(gè)偏振器之間利用Nomarski棱鏡觀察到的干涉條紋出現(xiàn)浮在空間上方幾毫米，棱鏡。然而，當(dāng)相同的條紋被視為使用Wollaston棱鏡，它們似乎在于內(nèi)部的棱鏡。利用Nomarski和渥拉斯頓棱鏡的干涉條紋的位置被稱為干涉平面。因?yàn)樵趥鹘y(tǒng)的渥拉斯頓棱鏡的干涉平面被定位在棱鏡的中央部，在約中心線之間的楔形件（圖6），它是難以適應(yīng)沃拉斯頓棱鏡的使用與標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡物鏡。該問(wèn)題是因?yàn)槔忡R的干涉平面必須一致，并且重疊的后側(cè)焦點(diǎn)面（也稱為衍射面）的物鏡，這往往在于以下的玻璃透鏡元件的內(nèi)螺紋安裝。

大多數(shù)制造商規(guī)避的物鏡孔徑間隙問(wèn)題通過(guò)采用諾馬斯基（偶爾被稱為改性沃拉斯頓）棱鏡聚光鏡和物鏡焦平面梁剪切和重組的職責(zé)，分別。由于一個(gè)專門設(shè)計(jì)的，如下面所討論的，利用Nomarski棱鏡的干涉平面位移到一個(gè)站點(diǎn)以外的棱鏡，而不是在傳統(tǒng)的沃拉斯頓設(shè)計(jì)的楔形元件跨越幾個(gè)毫米。利用Nomarski棱鏡不要求物理上位于物鏡或聚光鏡焦平面，但可以定位一些距離。利用Nomarski棱鏡雖然不產(chǎn)生更好的對(duì)比度，它們避免了潛在的問(wèn)題，干涉條紋變得不可見視。應(yīng)該指出的是徠卡顯微一旦產(chǎn)生一種流行的顯微鏡被稱為史密斯的T微分干涉對(duì)比系統(tǒng)，其中納入標(biāo)準(zhǔn)的渥拉斯頓棱鏡到特別設(shè)計(jì)的物鏡。然而，這樣的設(shè)計(jì)策略是罕見的例外，而不是規(guī)則。

利用Nomarski棱鏡，像一個(gè)Wollaston棱鏡，由膠合在一起為斜邊的兩個(gè)光學(xué)石英楔子。楔常規(guī)渥拉斯頓石英楔子是相同的，并具有的光軸取向平行于棱鏡表面。然而，修改的第二楔形切割石英晶體，以這樣的方式相對(duì)于平坦面的棱鏡的光軸傾斜的方向。當(dāng)楔塊相結(jié)合，形成復(fù)合棱鏡的雙折射，在焦平面（和干涉條紋的產(chǎn)生當(dāng)偏振光通過(guò)棱鏡時(shí)）之外的棱鏡板中，如上所述，如圖6所示。產(chǎn)生這種情況的，因?yàn)楝F(xiàn)在的剪切發(fā)生在空氣 - 石英界面的下楔塊，石英楔之間的界面處的折射導(dǎo)致剪切的波陣面的銜接交叉點(diǎn)以外的棱鏡。利用Nomarski棱鏡焦平面的實(shí)際位置可以調(diào)整超過(guò)幾個(gè)毫米的范圍內(nèi)，通過(guò)改變?cè)诘诙⑿ㄗ佑脕?lái)構(gòu)造棱鏡的光軸的傾斜角度。

盡管利用Nomarski棱鏡廣泛為物鏡棱鏡，在現(xiàn)代微分干涉相襯顯微鏡，有較少的電容式棱鏡的空間的限制，而這往往是孔徑平面內(nèi)精確定位。因此，常規(guī)的渥拉斯頓棱鏡有時(shí)可以被插入顯微鏡聚光鏡，但在許多情況下，利用Nomarski棱鏡代替。在聚光鏡中被利用時(shí)，利用Nomarski棱鏡，棱鏡的設(shè)計(jì)，以產(chǎn)生干涉平面位于更接近于棱鏡比用于與物鏡構(gòu)成。其結(jié)果是，除了被安裝在具有不同幾何形狀的幀，利用Nomarski棱鏡發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)代DIC顯微鏡不同的被切斷，并且是不可互換的?？傊瑢?duì)于微分干涉顯微鏡，聚光鏡棱鏡（也稱為作為次要的，輔助或補(bǔ)償?shù)?/span>復(fù)合棱鏡）作為一個(gè)主剪切分束器的偏振波陣面的物鏡棱鏡（主體棱鏡），而重組的分離波和調(diào)節(jié)的程度低下之間的平凡和不平凡的波陣面。

重要的是要記住，對(duì)準(zhǔn)顯微鏡科勒照明是一個(gè)重要和必要的步驟，以確保正確的定位，利用Nomarski棱鏡干涉平面與聚光鏡和物鏡的共軛孔徑平面重合。中央，或零階的干涉條紋，這是觀察時(shí)，利用Nomarski棱鏡被放置在交叉的偏振器（如上面所述），可以用于在顯微鏡的取向，以確定正確的方向的棱鏡。

DIC波前關(guān)系和圖像形成

從所述聚光鏡的渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡的孔徑平面出現(xiàn)后，剪切的普通和特殊的相干波陣面聚焦透鏡元件的檢體之前，由物鏡收集聚光鏡和穿越。沿著它們的軌跡在聚光鏡和物鏡之間保持相互平行地，波陣面分離由來(lái)自聚光棱鏡的幾何約束進(jìn)行的剪切距離。波陣面（剪切的距離）之間的空間距離隨聚光鏡和物鏡的數(shù)值孔徑，但現(xiàn)在在0.1和1.5微米之間的實(shí)際的限制，被設(shè)計(jì)為稍小于（或等于在某些情況下）的橫向分辨率的線性范圍的物鏡。微分干涉對(duì)比分辨率可以增加（在對(duì)比度為代價(jià)的）通過(guò)減少剪切距離大約一半的物鏡的最大分辨率。

大多數(shù)顯微鏡制造商上的剪切與距離分辨率和對(duì)比度權(quán)衡妥協(xié)，產(chǎn)生棱鏡有一個(gè)最大的剪切距離約0.6微米較低倍物鏡（10倍）下降到最低接近0.15微米的高倍率物鏡（60X和100X）。不管剪切距離，然而，重要的是要注意，緊密間隔的波陣面的對(duì)，空間上分布在整個(gè)顯微鏡的光圈，樣品試樣的每一個(gè)點(diǎn)在圖像平面上的雙光束干涉，以最終提供。

當(dāng)受到檢體的存在下，相干波前對(duì)遇到相同的試樣和圖像平面之間的光程差，到達(dá)物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面，具有相同相位的關(guān)系，當(dāng)他們離開聚光鏡。利用Nomarski棱鏡位于后面的物鏡重組的波陣面在物鏡的焦平面，以產(chǎn)生具有臺(tái)下偏振器的透射軸相同的方向電矢量振動(dòng)的直線偏振光。阻止通過(guò)第二偏振片（或分析儀）的偏振器（圖7（a）和圖7（b）），它具有一個(gè)透射軸取向垂直于退出物鏡棱鏡的線性偏振的波陣面。其結(jié)果是，出現(xiàn)在視場(chǎng)中觀察到的圖像的背景很暗或黑，簡(jiǎn)稱為消光的條件。

沒(méi)有試樣引起的相移，聚光棱鏡的光束分離動(dòng)作的精確匹配，逆轉(zhuǎn)的物鏡利用Nomarski棱鏡最終產(chǎn)生直線偏振光束重組效果。換句話說(shuō)，當(dāng)在顯微鏡科勒照明（高分辨率微分干涉顯微鏡的重要先決條件）而正確的配置，聚光鏡和物鏡的協(xié)同運(yùn)行，投射圖像到物鏡棱鏡的光源和聚光棱鏡。物鏡利用Nomarski棱鏡，方向反轉(zhuǎn)相對(duì)于聚光鏡棱鏡，介紹了精確地補(bǔ)償由聚光棱鏡產(chǎn)生的波陣面之間的非線性相移的相移。這個(gè)動(dòng)作發(fā)生的所有配對(duì)的波陣面在整個(gè)顯微鏡光圈。聚光鏡和物鏡棱鏡的軸以45度角度的交叉的偏振器（偏振器和分析器）的透射軸相對(duì)于彼此的取向?yàn)槠叫?。兩個(gè)棱鏡的取向軸的被稱為剪切軸，一個(gè)重要的概念，定義的時(shí)候，他們離開聚光棱鏡的普通和特殊的波陣面的軸線之間的橫向間隔，直到它們被由物鏡棱鏡復(fù)合到達(dá)圖像平面。

波前畸變在發(fā)生相干成對(duì)的波陣面遇到標(biāo)本中存在的相位梯度，而通過(guò)從聚光鏡的物鏡，被誘導(dǎo)的波將經(jīng)過(guò)沿剪切方向的相移，并遍歷稍微不同的光路（雖然沒(méi)有變化極化而發(fā)生）。當(dāng)?shù)竭_(dá)物鏡棱鏡，相移成對(duì)的波陣面被重新組合，以產(chǎn)生橢圓偏振光（在相反的直線偏振光，在沒(méi)有制作的標(biāo)本）。電位移矢量所得到的波陣面，而不再是平面的，掃出一個(gè)橢圓形的通路，因?yàn)樗┰降?/span>物鏡棱鏡和分析儀（圖7（c）中示出）之間的區(qū)域。因?yàn)榉治鰞x的透射軸平行的橢圓形的波陣面的一個(gè)組成部分，通過(guò)分析儀的波的某些部分，并產(chǎn)生具有有限的幅度和最終能夠產(chǎn)生圖像平面中的強(qiáng)度的平面偏振光。

總之，試樣中的光路梯度引起的相移，在配對(duì)的相干波陣面的剪切由聚光棱鏡，通過(guò)對(duì)平行的軌跡。這些相移被翻譯成由物鏡利用Nomarski棱鏡的相位差，創(chuàng)建橢圓偏振光，是能夠通過(guò)線性成分通過(guò)分析器創(chuàng)建映像。事實(shí)上，在整個(gè)試樣字段，創(chuàng)建的相位梯度的存在或不存在線性和橢圓偏振的波陣面，有選擇地通過(guò)其振動(dòng)平面的方位角的分析裝置的組合?？梢酝ㄟ^(guò)分析儀的波陣面都是平面平行的，并可以產(chǎn)生一個(gè)試樣的振幅圖像，通過(guò)在圖像平面上的干擾。當(dāng)物鏡棱鏡精確地補(bǔ)償聚光鏡棱鏡（因?yàn)樗诳评照彰鳎┑挠绊?，分析儀塊的波陣面在源自該字段的所有空間位置的缺乏（沒(méi)有檢體相的梯度）的相移。由此產(chǎn)生的背景是暗視場(chǎng)觀察（參展總滅絕）的異常陡峭標(biāo)本折射率或厚度梯度，這似乎更亮（通常以大綱形式）的區(qū)域顯示。形象出現(xiàn)的經(jīng)典，簡(jiǎn)單，暗場(chǎng)照明技術(shù)所產(chǎn)生的圖像非常相似。

這些概念被描繪在圖8中，其中提出后通過(guò)相試樣（具有較高的折射率比周圍介質(zhì)中），和它們相應(yīng)的振幅（或強(qiáng)度）的配置文件在圖像平面的剪切波陣面之間的相位關(guān)系的圖形。相互垂直的波陣面（標(biāo)記為Σ（1）和Σ（2） ，請(qǐng)參閱圖8（a）），通過(guò)試樣的扭曲，并顯示局部區(qū)域的相位延遲（稱為差分相位延遲）。的物鏡利用Nomarski棱鏡重組取消引入由聚光棱鏡的角波剪切的波前的波前變形的過(guò)程中產(chǎn)生的橫向位移。波前畸變型材（平凡和普通的組件）在圖像平面重建沿剪切軸線的說(shuō)明在圖8（a）在雙棱鏡儀器配置已經(jīng)調(diào)整到最大的滅絕。試樣引入的波陣面的相位延遲（φ）表示的剪切軸（x）的浸沿的寬度，而在縱坐標(biāo)上（以納米為單位）表示放大的試樣直徑（在這種情況下，一個(gè)單一的液滴的油狀物）。

在圖8（a）的波陣面的相位滯后后已發(fā)送通過(guò)分析器團(tuán)聚在圖像平面和相消干涉，由此產(chǎn)生的強(qiáng)度分布沿剪切方向（圖8的振幅積可以表示為（ b）段）。對(duì)于本例中考慮對(duì)稱的油滴標(biāo)本，作為剪切軸之間的距離的函數(shù)的振幅的積產(chǎn)生暗的兩側(cè)是明亮的區(qū)域（參見圖8（b））的中心空腔。數(shù)字圖像的實(shí)際標(biāo)本在顯微鏡下觀察（圖8（C））顯示明亮的邊緣疊加在黑色的背景和暗干涉條紋帶中心的球形微。圖8中的圖像被記錄在一個(gè)直立顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的配置與DIC。倒立組織培養(yǎng)顯微鏡產(chǎn)生基本相同的結(jié)果，但是，中央干涉條紋二等分的半球狀的油滴將定向?yàn)榇怪庇趫D圖8（c）中所示的那些。

介紹偏置遲緩的

調(diào)整最大的滅絕在微分干涉對(duì)比顯微鏡，視場(chǎng)呈現(xiàn)一片漆黑，幾乎是黑色的，背景，表現(xiàn)出非常高的靈敏度標(biāo)本地區(qū)，同時(shí)具有增加和減少相梯度。圖圖8（c）中所示，一些標(biāo)本細(xì)節(jié)模糊或非常困難的，以解決在此配置中，可以遍歷突出的特點(diǎn)，常?？梢杂^察到的干涉條紋的零級(jí)。在實(shí)踐中，物鏡利用Nomarski棱鏡沿剪切軸的橫向偏移量，均勻地轉(zhuǎn)移通過(guò)試樣的普通和特殊的波陣面的相對(duì)的相位位移。因此，從物鏡棱鏡出現(xiàn)的光的偏振矢量方向可以調(diào)整，從線性到各種程度的橢圓形，甚至圓形。相對(duì)于普通的波陣面的相位移的轉(zhuǎn)移的非凡的波陣面通過(guò)翻譯的物鏡棱鏡通常被稱為偏置相位差在DIC的顯微鏡的介紹。

為物鏡利用Nomarski棱鏡橫向移動(dòng)（或者左側(cè)或右側(cè)的顯微鏡的光學(xué)軸），波前對(duì)背景越來(lái)越滯后的相位與相對(duì)于彼此。其結(jié)果是，在進(jìn)入分析儀的波陣面的橢圓偏振的程度增加，背景強(qiáng)度逐步轉(zhuǎn)換從黑到介質(zhì)和較輕的灰色陰影。此外，引入的偏置相位差的變化的零級(jí)干涉條紋的位置，并產(chǎn)生相應(yīng)的變化，在該樣本中的相位梯度的強(qiáng)度水平。這些取向依賴目前較亮的背景顏色通常被稱為零階灰度明亮的區(qū)域和黑暗的陰影疊加產(chǎn)生的結(jié)果。最終DIC圖像不依賴于被引入完全通過(guò)翻譯的物鏡棱鏡的光程差，并沿顯微鏡光軸聚光棱鏡時(shí)，可以得到相同的結(jié)果。然而，在大多數(shù)儀器，它是更為方便的產(chǎn)生偏置相位差，通過(guò)移動(dòng)的物鏡的位置，而不是安裝在聚光鏡中的炮塔的棱鏡的棱鏡。

通過(guò)改變偏置相位差引入到試樣發(fā)生亮度梯度沿剪切軸的聚光鏡和物鏡棱鏡，一般出現(xiàn)源自以45度角（西北部到東南或反之亦然）時(shí)，觀察到的試樣目鏡（參見圖8（f）條）。請(qǐng)注意，在圖8中所示的梯度（六）被記錄，與一個(gè)正立顯微鏡。倒置顯微鏡生產(chǎn)強(qiáng)度梯度，面向垂直直立顯微鏡中觀察到的那些。在一個(gè)方向或另一個(gè)會(huì)影響干涉條紋偏移和改變普通和非凡的波陣面之間的相位關(guān)系（智障或高級(jí)），從而扭轉(zhuǎn)了陰影投在試樣方向移動(dòng)棱鏡。

引入偏置相位差的凈結(jié)果是使試樣在偽三維浮雕圖像增加光程差（傾斜的相位梯度）的區(qū)域出現(xiàn)明亮的（或暗），和那些表現(xiàn)出路徑長(zhǎng)度減小出現(xiàn)在反向。試樣的功能出現(xiàn)類似的高原升高或凹陷的凹部，根據(jù)相位梯度方向，這是一個(gè)顯著特征的微分干涉對(duì)比。然而，三維外觀只對(duì)應(yīng)相梯度，不應(yīng)該被混淆與實(shí)際試樣的幾何形狀（如過(guò)于頻繁的情況下）。在某些情況下，實(shí)際的地形特征也是不斷變化的相位梯度的網(wǎng)站，但作為獨(dú)立的調(diào)查的結(jié)果，獲得的信息的情況下，這個(gè)事實(shí)不應(yīng)假定。

在微分干涉顯微鏡的偏置相位差簡(jiǎn)介圖圖8（d）中示出通過(guò)圖8（f）就組成的多個(gè)半球狀的油滴的相位標(biāo)本。當(dāng)在顯微鏡調(diào)整最大消光，顯示普通和特殊的波陣面沿剪切方向的相移，但不表現(xiàn)出背景的對(duì)應(yīng)的區(qū)域（圖8（a））的相位差。翻譯的物鏡棱鏡的偏置相位差此外一個(gè)波陣面之間的相對(duì)相位移位相對(duì)于其他的（圖圖8（d）），但保持相同的波陣面的剪切。干擾的像面，產(chǎn)生的振幅（或強(qiáng)度）的積，作為剪切距離的函數(shù)（圖圖8（e））后，顯示一個(gè)明亮的邊緣區(qū)域的一側(cè)上的油滴和暗區(qū)域的相對(duì)側(cè)上。在顯微鏡中觀察時(shí)，試樣顯示出陰影鑄態(tài)的外觀，就好像它是從一個(gè)高度傾斜的角度（參見圖8（六））照射。為了觀察最大消光之間的差別，除了偏置相位差，比較試樣圖像呈現(xiàn)在圖圖8（c）及（f）。的陰影的方向，這是依賴于剪切軸（圖8中的（c）和（f）段），在相反的方向上按相同的量的物鏡棱鏡翻譯可以扭轉(zhuǎn)的雙頭箭頭。

偏置已翻譯物鏡利用Nomarski棱鏡沿著光軸來(lái)回使用微調(diào)旋鈕位于端的安裝框（通常放置在顯微鏡的物鏡轉(zhuǎn)換器殼體或中間管）引入傳統(tǒng)的微分干涉差顯微鏡。一種替代技術(shù)，這是日益深入人心，是四分之一波長(zhǎng)相位差板的安裝在固定的方向之間的偏光器和聚光鏡的棱柱（稱為Sénarmont DIC補(bǔ)償）。最大消光，相位差板的快軸與偏振器的透射軸對(duì)齊，兩個(gè)光學(xué)單元可以是（往往都是）的基礎(chǔ)上，在顯微鏡的同一殼體內(nèi)包含。去Sénarmont補(bǔ)償器的備用位置，在顯微鏡配備適當(dāng)?shù)闹虚g管的物鏡棱鏡和分析儀之間。

為了使引入的偏置使用去Sénarmont補(bǔ)償器，偏振器的透射軸旋轉(zhuǎn)（加或減45度）的相位差板，保持固定在一個(gè)90度角相對(duì)于分析儀的快軸相對(duì)于傳輸軸。當(dāng)補(bǔ)償器的快軸相一致（平行）與偏振器的透射軸，只有直線偏振光通過(guò)通過(guò)去Sénarmont補(bǔ)償器的聚光棱鏡。但是，當(dāng)偏振器的透射軸旋轉(zhuǎn)時(shí)，從四分之一波長(zhǎng)的相位差板的過(guò)程中出現(xiàn)的波陣面成為橢圓偏振光。旋轉(zhuǎn)偏振器在一個(gè)方向上會(huì)產(chǎn)生右撇子的橢圓偏振光，旋轉(zhuǎn)的同時(shí)在另一個(gè)方向上的偏振器將改變矢量軌跡生成一個(gè)左手系的橢圓掃描。

當(dāng)起偏器的透射軸的方向達(dá)到無(wú)論是加或減45度（相等于四分之一波長(zhǎng)的相位差），補(bǔ)償器的光通過(guò)圓偏振光（再次在任何一個(gè)慣用左手或右手的意義上）。因?yàn)闄E圓或圓偏振光代表的普通和特殊的新興的從去Sénarmont補(bǔ)償?shù)牟嚸嬷g的相位差，偏置引入到系統(tǒng)的波前進(jìn)入聚光鏡棱鏡和剪切。正偏壓時(shí)，得到的偏振片在一個(gè)方向上旋轉(zhuǎn)，而通過(guò)在相反的方向旋轉(zhuǎn)偏振器引入負(fù)偏壓。

不管偏置是否被引入到翻譯的物鏡利用Nomarski棱鏡或旋轉(zhuǎn)的偏振片上解Sénarmont補(bǔ)償由一個(gè)微分干涉對(duì)比系統(tǒng)，最終結(jié)果是相同的。正如前面討論的，在一個(gè)正確配置的顯微鏡，科勒照明，圖像的光源和聚光棱鏡是由光學(xué)系統(tǒng)（聚光鏡和物鏡）轉(zhuǎn)移到位于上面的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面倒立的第二利用Nomarski棱鏡對(duì)準(zhǔn)。整個(gè)面部的聚光棱鏡的線性相移被精確地補(bǔ)償由一個(gè)相反的相移在物鏡棱鏡。翻譯的物鏡棱鏡沿剪切方向不改變的相移分布，而是，添加或減去一個(gè)恒定的相位差在整個(gè)顯微鏡的光圈。旋轉(zhuǎn)在去Sénarmont補(bǔ)償偏振器中相同的方式，還引入了一個(gè)變量，并控制相位差。匹配的棱鏡系統(tǒng)使圖像形成發(fā)生與每一個(gè)波前對(duì)投影來(lái)自聚光鏡的孔徑相同的偏置電壓的相位差，不論路由通過(guò)它穿過(guò)試樣到達(dá)物鏡。

如圖9所示的是一系列的數(shù)字圖像記錄在DIC使用偏置在一些中間步驟中的二十分之一到四分之一波長(zhǎng)的相位差范圍。樣品是15微米邊的固定和安裝小鼠小腸包含波動(dòng)厚度的區(qū)域。的試樣細(xì)節(jié)和陰影鑄的偽三維效果是最顯著的在較低的偏置相位差值（圖9（a）和圖9（b）），但細(xì)標(biāo)本細(xì)節(jié)的對(duì)比度和清晰度都惡化，作為偏置相位差的移交增加（圖9（c）到9（f）條）。在偏置遲緩最高值（四分之一波長(zhǎng);圖9（F）），對(duì)比度極差，極少數(shù)的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)可見。對(duì)于這個(gè)特殊的試樣，最佳相位差范圍介于的二十分之一的波長(zhǎng)的十二分之一。

作為光路梯度增加的標(biāo)本，因此圖像對(duì)比度。改變偏置相位差在不同程度上也可以產(chǎn)生顯著的對(duì)比目鏡（圖9）中所觀察到的試樣中的波動(dòng)。在一般情況下，誘導(dǎo)的翻譯的物鏡棱鏡，或通過(guò)旋轉(zhuǎn)在去Sénarmont補(bǔ)償偏振器之間的普通和特殊的波陣面的位移，是最佳的程度上的順序小于十分之一波長(zhǎng)。但是，該值是在很大程度上依賴于試樣的厚度，有用的范圍的生物樣本的偏置相位差之間的三十分之一和四分之一波長(zhǎng)。對(duì)比標(biāo)本中具有非常大的光學(xué)梯度往往可以受益于更大的偏置相位差值（全波長(zhǎng)）。成一個(gè)微分干涉對(duì)比顯微鏡使偏置遲緩階段更容易被觀察的標(biāo)本，并與傳統(tǒng)的膠片或數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)，極大地方便了成像努力。

在DIC顯微鏡補(bǔ)償遲緩板

偏置微分干涉對(duì)比普通和特殊的波陣面之間的相位差，也可以通過(guò)使用最初的物鏡作為定量的相位差測(cè)量裝置和偏振光顯微鏡的對(duì)比增強(qiáng)元素的補(bǔ)償操作。補(bǔ)償板賦予更大的控制，用于調(diào)整試樣的細(xì)節(jié)的對(duì)比度有關(guān)的背景強(qiáng)度和顏色值中，并且也能夠更精確地調(diào)整的波陣面之間的偏差值。這些雙折射元件也經(jīng)常采用的光學(xué)透明的標(biāo)本的染色，通常呈現(xiàn)在有限范圍內(nèi)的灰度值。

當(dāng)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的物鏡利用Nomarski棱鏡翻譯顯微鏡沿光軸的四分之一波長(zhǎng)，這兩種試樣的功能，并獲得一個(gè)頻譜牛頓干涉色偏振光顯微鏡中觀察到的相似的背景之外的路徑差。試樣和背景的顏色過(guò)渡，通過(guò)一系列的灰度值，通過(guò)白色，黃色，紅色，藍(lán)色和高階遷移變得光染色。光學(xué)染色產(chǎn)生的戲劇性和精美的彩色圖片，但對(duì)科學(xué)應(yīng)用的用途有限。通常情況下，最佳的標(biāo)本的對(duì)比被限制到二十分之一到四分之一波長(zhǎng)的相位差的范圍內(nèi)。

補(bǔ)償器可以插入到物鏡棱鏡和分析儀或偏振器和聚光鏡棱鏡之間的DIC顯微鏡的光學(xué)路徑。許多顯微鏡在中間管或?yàn)榇?/span>物鏡而設(shè)計(jì)的臺(tái)下聚光器殼體有一個(gè)插槽。另外的一階補(bǔ)償器（通常稱為全波或一階的紅色板）具有等于全波長(zhǎng)的可見光（約550納米），綠色區(qū)域中的延遲值，引入了頻譜的干涉色檢體和背景。與補(bǔ)償器代替，綠色光無(wú)法通過(guò)分析儀，因?yàn)樗鼜呐c偏振器的電場(chǎng)矢量具有相同的方向的線偏振光的相位差板。然而，在紅色和藍(lán)色光譜區(qū)域的波陣面發(fā)生相位差小于一個(gè)波長(zhǎng)，成為橢圓偏振光，使他們能夠通過(guò)分析器傳遞組件。其結(jié)果是，這些顏色混合形成的視場(chǎng)中的品紅色的背景。

因此，當(dāng)試樣中觀察到的白色光微分干涉對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)和一階補(bǔ)償，背景顯示品紅色，而在將顯示在二階的藍(lán)色和黃色的顏色的一階（視方向而定）的圖像的對(duì)比度牛頓干涉色譜。補(bǔ)償?shù)轿坏姆g諾馬斯基棱鏡（或旋轉(zhuǎn)偏光鏡在一個(gè)Sénarmont補(bǔ)償），具有大光學(xué)相位梯度結(jié)構(gòu)中觀察到的干涉色產(chǎn)生快速變化，小的變化獲得偏置遲緩的。這種技術(shù)是有用的顏色（光染色）引進(jìn)具有高折射率的界限，如細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)顆粒大，纖毛和細(xì)胞核的地區(qū)。標(biāo)本功能顯示的干涉色，可以比較在米歇爾征收的比色圖表獲得的估計(jì)值的光程差的值。

在圖10中示出幾個(gè)透明的標(biāo)本已光學(xué)染色，呈現(xiàn)在偽三維浮雕通過(guò)DIC的光學(xué)技術(shù)。圖10（a）示出口的犬鉤蟲（犬鉤蟲），而圖10（b）的特點(diǎn)是在突起的邊緣處的櫛魚鱗。圖10（三）大，豹紋蛾（Ecpantheria scribonia）的七彩翅膀上的鱗片。在所有情況下，利用Nomarski棱鏡被翻譯通過(guò)顯微鏡光軸的偏置相位差值，該值超過(guò)全波長(zhǎng)。雖然這些圖像不顯示隱藏的科學(xué)信息有關(guān)的標(biāo)本，他們這樣做有可能提前DIC的光學(xué)顯微鏡技術(shù)，作為一個(gè)合法的科學(xué)和藝術(shù)之間的橋梁。

開成一個(gè)微分干涉對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)引入偏置與解Sénarmont補(bǔ)償顯微鏡配備一個(gè)全波的相位差板可以被添加到光學(xué)染色試樣與牛頓的干涉色，并提供更多的定量信息的路徑差。如上所述，Sénarmont補(bǔ)償經(jīng)常采用DIC的顯微鏡取得的偏置相位差的精確測(cè)量的水平，但該設(shè)備也是有用的，監(jiān)視對(duì)應(yīng)的光學(xué)組件。在視頻的增強(qiáng)型DIC的顯微鏡，去Sénarmont補(bǔ)償往往利用優(yōu)化對(duì)比度標(biāo)本細(xì)節(jié)在于顯微鏡的分辨率極限以下。

DIC圖像的解釋

其中最顯著和廣受認(rèn)可的微分干涉對(duì)比顯微鏡獲得的圖像方面是高度可見的浮雕，表現(xiàn)通過(guò)賦予偽三維寫實(shí)的陰影投效果。在一般情況下，標(biāo)本出現(xiàn)，通過(guò)光從低角度與高度傾斜的光源，讓人聯(lián)想得到的結(jié)果與傳統(tǒng)的斜照明或霍夫曼調(diào)制對(duì)比。然而，謹(jǐn)慎，圖像應(yīng)始終被解釋與理解的陰影和高光的影子投引渡相或光學(xué)路徑漸變指示標(biāo)志和坡向，不一定透露精確的幾何或地形參數(shù)。

從觀察在幾乎每一個(gè)產(chǎn)生的圖像通過(guò)偏置相位差的陰影鑄造定向本，光學(xué)剪切方向是明顯的，可以精確地定義為顯示的最高和最低亮度值的區(qū)域的軸線連接。應(yīng)考慮的另一個(gè)考慮因素是檢體之間的關(guān)系及其周圍介質(zhì)中，因?yàn)殛幱暗姆较蛲ǔＯ喾丛嚇泳哂休^高或較低的折射率比周圍的詳細(xì)信息。其結(jié)果，致密的亞細(xì)胞顆粒，如細(xì)胞核，核仁，線粒體，細(xì)絲，中期染色體，，溶酶體通常顯示提出的海拔（小山頂）的外觀，而較低折射率的夾雜物（例如，吞飲小泡，水空泡，脂滴）似乎是凹陷的凹部（凹）。

檢體相梯度（偽立體感的程度）的微分干涉對(duì)比賦予的對(duì)比度電平是翻譯諾馬斯基棱鏡或旋轉(zhuǎn)偏振器去Sénarmont中的，由該光學(xué)系統(tǒng)引入的量的偏置相位差的函數(shù)補(bǔ)償器。因?yàn)槔?/span>Nomarski和渥拉斯頓棱鏡的設(shè)計(jì)和其他約束涉及微分干涉對(duì)比的波陣面取向的剪切軸是固定的，不能被改變的軸線方向上影響標(biāo)本的對(duì)比，通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的顯微鏡上的設(shè)置。然而，普通和非凡的波陣面之間的相對(duì)相位延遲是可以逆轉(zhuǎn)的搬遷物鏡棱鏡，從一個(gè)側(cè)面顯微鏡的光學(xué)軸（偏置遲緩轉(zhuǎn)移由負(fù)轉(zhuǎn)正，或反之亦然）。此操作也可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)偏振器上去Sénarmont的補(bǔ)償器的相應(yīng)的負(fù)值。當(dāng)相位延遲被改變?nèi)鐒偛潘觯谠嚇由系牧羺^(qū)和暗邊的方向扭轉(zhuǎn)180度。在本質(zhì)上，可改變相對(duì)于試樣的剪切軸的顯微鏡的唯一機(jī)制是為調(diào)整試樣本身的一種手段，有利于從圓形360度可旋轉(zhuǎn)的階段（設(shè)計(jì)主要是為偏光顯微鏡）的利用率。

在微分干涉對(duì)比度的圖像，陰影和高光強(qiáng)度是最大的沿剪切軸的顯微鏡，和恒定的折射率的顯示亮度值是相同的背景區(qū)域的。當(dāng)檢查的試樣具有球形的幾何形狀（圖8（f）條）從幾個(gè)方位接壤的背景邊緣的對(duì)比度，它被發(fā)現(xiàn)是最小的對(duì)比度區(qū)域中垂直于剪切軸。事實(shí)上，試樣和背景之間的對(duì)比度差異逐漸減小，直到他們到達(dá)定義的零級(jí)干涉條紋（垂直于剪切軸）的軸線的方向中的最小值。在圖8（c）和圖8（f）中的試樣表現(xiàn)出最低級(jí)的對(duì)比度（無(wú)標(biāo)簽的白色箭頭指示的）的區(qū)域，在中心區(qū)的邊緣正好垂直于剪切軸的油滴。為了驗(yàn)證這個(gè)概念，比較干涉條紋滿足的背景圖像中的記錄，可在最大消光（圖8（c）條）的偏置相位差引入后生成的圖像中的相應(yīng)區(qū)域的邊緣（圖8（f） ）。無(wú)標(biāo)簽的白色箭頭標(biāo)記的區(qū)域，普通和特殊的波前畸變對(duì)齊的配置文件，減去取消剩余遲緩和屈服強(qiáng)度值完全匹配的背景分析儀。

在微分干涉顯微鏡檢查每個(gè)試樣將有一個(gè)最佳的偏置相位差設(shè)定在最終圖像中產(chǎn)生最大的對(duì)比度水平。非常薄的試樣顯示一個(gè)淺的折射率梯度，如活細(xì)胞的培養(yǎng)，一般可使用同樣低的偏置設(shè)置僅稍大于最大的相移標(biāo)本中存在（約一個(gè)波長(zhǎng)的二十分之一的順序，或約30納米）。然而，較厚的標(biāo)本往往需要較高的偏置設(shè)置（四分之一波長(zhǎng)）大型聚光鏡孔產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果，通常是通過(guò)光學(xué)切片。因?yàn)樵S多試樣組成的功能，顯示的各種不同的尺寸和折射率，最佳偏置相位差設(shè)置通常是一種妥協(xié)。

方位角微分干涉對(duì)比一些試樣的取向現(xiàn)象的影響列于圖11。在所有情況下，剪切軸指向西北向東南，但并不表示對(duì)個(gè)人的數(shù)字圖像。圖11（a）和11（b）示出的毛孔及皮紋所表現(xiàn)出的安裝來(lái)自硅藻布紋attenuatum的 frustule周期間距。當(dāng)長(zhǎng)軸的frustule的取向垂直于剪切軸（圖圖11（a）），毛孔合并成一系列緊密間隔的脊，單獨(dú)都沒(méi)有解決。與此相反中，剪切軸平行的方向上重新定位frustule揭示的旋鈕狀的幾何形狀的孔結(jié)構(gòu)在這樣的物種。

含鰓排骨淡水水蚤（水蚤），圖11（三）胸部區(qū)域。在該取向中，各個(gè)肋結(jié)構(gòu)都清晰可見（垂直于剪切軸線），并連接到一個(gè)共同的脊椎，顯示為剪切軸線平行的一長(zhǎng)系列的旋鈕。當(dāng)試樣旋轉(zhuǎn)90度（圖第11（d）），許多肋結(jié)構(gòu)失去對(duì)比度，脊髓旋鈕合并成一個(gè)單一的脊。最后，夾雜物在櫛魚鱗缺乏對(duì)比度和疊加在紋狀體棘（圖11（E））時(shí)，很難區(qū)分。試樣的旋轉(zhuǎn)帶來(lái)的的棘平行剪切軸（圖11（f）條），它們的對(duì)比度降低，使夾雜物清晰可見。

許多因素時(shí)，應(yīng)考慮調(diào)整偏置遲緩，產(chǎn)生最佳標(biāo)本的對(duì)比。水平偏差，必須引入最大限度地變暗一個(gè)斜坡或試樣邊緣也產(chǎn)生最大可能的試樣和背景之間的對(duì)比度。因此，對(duì)于每一個(gè)標(biāo)本，一個(gè)特定的物鏡棱鏡（或取消Sénarmont的補(bǔ)償器）設(shè)置通常會(huì)引入最大程度的對(duì)比。超過(guò)此值時(shí)，對(duì)比度會(huì)降低。較厚的標(biāo)本，經(jīng)常遭受來(lái)自光散射文物，通常需要一個(gè)更大的偏置遲緩設(shè)置（全波長(zhǎng)）比薄的標(biāo)本獲得具有顯著的階段梯度地區(qū)滅絕。最后，當(dāng)在聚光鏡中的可變光闌開口尺寸超過(guò)75％的物鏡后孔，減少過(guò)多的在光學(xué)系統(tǒng)中的光散射的結(jié)果對(duì)比。隨著這個(gè)困難時(shí)，請(qǐng)小心打開聚光鏡光圈以執(zhí)行光學(xué)切片實(shí)驗(yàn)。

光學(xué)切片

大型聚光鏡和物鏡的數(shù)值孔徑的微分干涉對(duì)比標(biāo)本圖像的能力，能夠創(chuàng)造顯著的淺光從一個(gè)集中的圖像部分。如果沒(méi)有光暈和側(cè)面去掉從焦點(diǎn)從明亮區(qū)域分散注意力的強(qiáng)度波動(dòng)的干擾，該技術(shù)得到銳利的圖像，都整齊地從復(fù)雜的三維相位標(biāo)本切片。此屬性通常利用取得清晰的輪廓，在復(fù)雜的組織細(xì)胞的光學(xué)部分的焦平面上的上方和下方的結(jié)構(gòu)以最小的干擾。

在所有傳統(tǒng)形式的透射和反射的光鏡，孔徑光闌聚光鏡發(fā)揮了重要作用，定義圖像的對(duì)比度和分辨率。產(chǎn)生增強(qiáng)的對(duì)比度的同時(shí)，減小光圈的大小字段和整體圖像的清晰度增加了深度。但是，如果隔膜被關(guān)閉太多，衍射工件變得清楚和分辨率犧牲。通常情況下，最佳的光圈設(shè)置是準(zhǔn)確地渲染足夠的對(duì)比度和保留圖像分鐘功能需要的分辨率，而避免衍射文物的標(biāo)本細(xì)節(jié)之間的一種折衷。

高性能的微分干涉差顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)與聚光鏡部分閉合的可變光闌（約70％的物鏡后的光圈大?。┊a(chǎn)生優(yōu)異的對(duì)比度，而且還當(dāng)膜片被打開以與物鏡孔徑大小相匹配性能極佳。為了實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片分辨率和對(duì)比度之間的最佳平衡，必須正確地配置在顯微鏡科勒照明棱鏡元件和偏振器應(yīng)精確對(duì)準(zhǔn)。高數(shù)值孔徑物鏡設(shè)計(jì)用于浸油只應(yīng)利用圖像試樣滑動(dòng)到聚光鏡的底部的油。

在高放大倍率和數(shù)值孔徑（例如，100倍和1.4），微分干涉對(duì)比景深接近一個(gè)限制值，約400納米（0.40微米，約1.5倍的橫向分辨率極限的物鏡）。通過(guò)一個(gè)人口腔上皮細(xì)胞在高放大倍率（100倍物鏡）和數(shù)值孔徑（1.30）的中央?yún)^(qū)域所拍攝的圖12中所示的光學(xué)部分。該單元格是約3微米厚的附近的細(xì)胞核中，利用取得的圖像在圖12中為約0.5微米的配置和景深。細(xì)菌是清晰可見的單元格（圖12（a））的上表面上，是平行的，在膜旋轉(zhuǎn)脊非常相似的手感的人的指紋。甲隆起對(duì)應(yīng)于細(xì)胞核膜在較低的中央部的圖中也可看到。當(dāng)焦平面被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部（圖12（b）條），核結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)顆粒變得可見。最后，在細(xì)胞膜放在顯微鏡載片上的表面（圖圖12（c））的下邊界，揭示許多折疊脊（的上表面上所觀察到的相似）。

當(dāng)執(zhí)行用較厚的生物標(biāo)本（特別是那些在水溶液中的鹽溶液浸漬）的光學(xué)切片實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須警惕的顯微鏡蓋玻片和安裝介質(zhì)之間的界面處的折射率不連續(xù)所產(chǎn)生的球面像差的可能引入。這些項(xiàng)目將降低分辨率的光學(xué)部分系列更高的穿透深度。

當(dāng)前甲顯著量的微分干涉對(duì)比理論的研究和開發(fā)集中在引人注物鏡光學(xué)切片的技術(shù)特征。最終，從標(biāo)本的三維折射率分布圖的定量估計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)通過(guò)計(jì)算模型。此外，目前的研究還沖著新車型正在開發(fā)的部分相干的透射光DIC的光學(xué)元件和圖像形成。

結(jié)論

微分干涉顯微鏡基本上是作微小的，一般的艾里斑的直徑稍小于剪切系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，將參考光束的光束剪切干涉。事實(shí)上，在該樣本中的每一個(gè)點(diǎn)所代表的兩個(gè)重疊的在最終圖像中，一個(gè)明亮，其他比背景暗的艾里磁盤?；镜娘@微鏡系統(tǒng)，首先由Francis史密斯1955設(shè)計(jì)，是修改后的兩個(gè)渥拉斯頓棱鏡附加的，一個(gè)聚光鏡的前焦面和第二物鏡的后焦平面的偏光顯微鏡。

后來(lái)的修改，建議由喬治利用Nomarski，使棱鏡相差的光學(xué)孔徑共軛平面在物理上位于。聚光鏡棱鏡將每個(gè)成兩個(gè)稍微移位，相對(duì)于彼此是正交偏振的平行光束，照射試樣，而物鏡棱鏡用于重新組合的光束的波陣面。鏡像到另一個(gè)由光學(xué)系統(tǒng)，這兩個(gè)棱鏡的組合，是在高數(shù)值孔徑的微分干涉對(duì)比，以形成銳利的圖像的能力的一個(gè)重要特征。

用梯度的幾何路徑長(zhǎng)度或試樣的折射率，這會(huì)導(dǎo)致在橢圓偏振光的合成光，退出物鏡Wollaston棱鏡被引入到兩個(gè)正交波陣面的相位差。偏置相位差可以被引入到系統(tǒng)翻譯的物鏡棱鏡沿顯微鏡光軸或通過(guò)四分之一波長(zhǎng)板的偏振器或分析儀相結(jié)合。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單的旋轉(zhuǎn)控制旋鈕，可以得到最佳的對(duì)比度，場(chǎng)亮度和靈敏度。

由此產(chǎn)生的DIC圖像具有陰影鑄態(tài)的外觀，有效地顯示為低和高的空間頻率的光學(xué)路徑的梯度。這些試樣的光路的區(qū)域增加沿基準(zhǔn)方向顯得更亮（或暗）的區(qū)域出現(xiàn)在路徑差減少，而以相反的對(duì)比度。陡峭的梯度光程差導(dǎo)致較大的反差。各種各樣的標(biāo)本與微分干涉相襯成像是很好的候選人，包括非常薄的細(xì)絲或尖銳的接口，從而產(chǎn)生良好的對(duì)比度，甚至當(dāng)他們的直徑低于光學(xué)系統(tǒng)的分辨率極限。

其中主要的微分干涉對(duì)比顯微鏡的成像優(yōu)勢(shì)是較小的標(biāo)本特征的形象，不像暗場(chǎng)或相襯，沒(méi)有遮擋相鄰的地區(qū)，具有較大的光學(xué)梯度。此外，中性灰色的背景上顯示的圖像的陰影鑄造，耦合到成像非常小的特征，連同那些大得多的靈敏度（例如，分鐘附屬物活細(xì)胞或動(dòng)態(tài)的夾雜物在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和移動(dòng)）傳統(tǒng)相襯技術(shù)是一個(gè)重大改進(jìn)。這些好處，除了對(duì)比度控制寬動(dòng)態(tài)范圍和淺景深，都促成了該技術(shù)的廣泛普及。

對(duì)比度在DIC的顯微鏡是有方向性的，表現(xiàn)出最大沿剪切的軸線和在正交方向最少。艾里斑分離（平均峰-峰的分離磁盤半徑的二分之一到三分之二）的方向與剪切軸的顯微鏡，它是最大對(duì)比度的方向相一致。其結(jié)果是，DIC對(duì)比度傳遞函數(shù)（CTF）也是方向沿著剪切軸。通過(guò)試樣的兩個(gè)波陣面之間的橫向位移大約一半的物鏡的分辨率極限。這種小程度的剪切力，誘導(dǎo)，由渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡類似的行動(dòng)，一個(gè)高通濾波器的空間頻率的對(duì)比度細(xì)節(jié)在試樣。相應(yīng)的調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）緊跟在明照明的高空間頻率觀察，但樣品的功能，超過(guò)幾個(gè)微米大小（空間頻率較低）顯示急劇下降。

適合在DIC的觀察標(biāo)本包括液涂片檢查，活細(xì)胞培養(yǎng)物，血細(xì)胞，亞細(xì)胞器，未染色的組織，染色體，原生動(dòng)物，胚胎，硅藻，聚合物，副本，以及比較厚的超薄切片。更多信息可以通過(guò)檢查振幅和相位幅度混合標(biāo)本，如天然色素原生生物，藻類和淡染的組織學(xué)標(biāo)本。該技術(shù)通常是組合使用，以顯示細(xì)胞形態(tài)與熒光區(qū)域熒光顯微鏡。當(dāng)耦合增強(qiáng)的視頻技術(shù)（稱為VEC-DIC的視頻增強(qiáng)的對(duì)比度微分干涉對(duì)比），DIC可以被用來(lái)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)，具有以下的尺寸的顯微鏡的光學(xué)分辨率的圖像。