徠卡顯微鏡 - 熒光壽命成像之FLIM-FRET應(yīng)用淺析

2020-09-04 09:57:49 admin
奧林巴斯顯微鏡

FRET 技術(shù)(Fluorescence Resonance Energy Transfer)能夠在突破傳統(tǒng)光學(xué)分辨率極限的條件下研究蛋白互作、構(gòu)象變化(<10 nm),或者通過構(gòu)建 FRET 探針監(jiān)測分子變化,因而在諸多研究領(lǐng)域得到了“科研大拿”們的青睞。然而,傳統(tǒng)的基于熒光強(qiáng)度的 FRET 技術(shù)(如 FRET-AB、FRET-SE 等)容易受到熒光蛋白濃度、激光強(qiáng)度、熒光漂白等眾多因素的影響,從而直接導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性和難重復(fù)性,著實(shí)讓人頭疼!


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△ 圖1. 常用 FRET 染料對 Alexa488-Cy3 的 Jablonski 圖表



FLIM 顯微成像技術(shù)

FLIM-FRET 的優(yōu)勢

FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一項(xiàng)基于熒光壽命(電子駐留在激發(fā)態(tài)的時(shí)間統(tǒng)計(jì)值)的顯微成像技術(shù)。與熒光光譜一樣,熒光壽命也是熒光物質(zhì)的一種內(nèi)在特有性質(zhì),不受熒光物質(zhì)濃度、激發(fā)光強(qiáng)度等因素的影響。基于熒光壽命測量的 FRET 技術(shù)—— FLIM-FRET,具有 FLIM 和 FRET 兩者的優(yōu)勢,即能在不受熒光強(qiáng)度影響因素影響的條件下,在納米分辨率水平對蛋白互作進(jìn)行研究,或者通過 FRET 探針研究分子環(huán)境變化,更重要的是其測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高、易重復(fù),接下來我們來看兩個(gè)例子。


案例解析


案例一

離子溶度監(jiān)測

今年發(fā)表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 細(xì)胞中的重要作用。


作者通過對免疫缺陷病人進(jìn)行基因篩查,發(fā)現(xiàn)了 ZIP7 蛋白的缺失,利用 CRISPR-CAS9 技術(shù)構(gòu)建了該基因缺失的小鼠模型,并利用該模型證明了 ZIP7 缺失會導(dǎo)致 B 細(xì)胞發(fā)育受阻。ZIP7 介導(dǎo) Zn2+ 由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流入細(xì)胞質(zhì),為了證明 ZIP7 缺失的細(xì)胞中 Zn2+ 濃度受到了影響,作者通過 FRET 探針 eCALWY-4、eCALWY-6 進(jìn)行了研究,然而傳統(tǒng)的FRET技術(shù)會受到探針濃度的影響從而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確,因此作者利用了 FLIM-FRET 技術(shù),證明 ZIP7 突變體細(xì)胞質(zhì)中 Zn2+ 濃度明顯下降,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了 ZIP7 調(diào)控的 Zn2+ 水平對 B 細(xì)胞發(fā)育的重要性。

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△ 圖2. 利用 FLIM-FRET 技術(shù)檢測細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中 Zn2+ 濃度。P198A Hom,ZIP7 突變體;eCALWY-4、eCALWY-6 ,Zn2+  FRET reporters ; ER,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)



案例二

活體功能成像

FRET 探針不僅可用在細(xì)胞水平,in vivo 個(gè)體水平也同樣適用。


“Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探針對小鼠小腸、胰腺等組織中的 Rac1 活性進(jìn)行了監(jiān)測。然而,傳統(tǒng)的 FLIM 技術(shù)成像速度非常慢,在活體應(yīng)用時(shí),由于時(shí)間分辨率不夠會導(dǎo)致數(shù)據(jù)的假象。該文通過算法將這種成像速度不夠?qū)е碌募傧筮M(jìn)行了*大程度的消除,從而在一定程度上促進(jìn)了 FLIM 在活體水平的應(yīng)用,該文章發(fā)表在2018年 eLife 雜志上。

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△ 圖3. 左,Rac1 FRET 探針檢測小腸隱窩處 Rac1 活性模式圖;右,運(yùn)動(dòng)補(bǔ)償運(yùn)算前后 FLIM 數(shù)據(jù)對比



SP8 FALCON *快速熒光壽命成像

解決 FLIM 成像速度*大瓶頸

當(dāng)然, FLIM 應(yīng)用并不僅限于 FLIM-FRET,通過 FLIM 還可以對樣本所處的微環(huán)境進(jìn)行檢測、對樣品組份進(jìn)行分離等等。在傳統(tǒng)的熒光強(qiáng)度和熒光光譜兩個(gè)維度的基礎(chǔ)上,又增加了熒光壽命這一新的成像維度,大大拓展了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。


然而,正如 Sean C Warren eLife 文章所說,F(xiàn)LIM 成像速度慢是限制其應(yīng)用的*大瓶頸。


Leica*新 SP8 FALCON *快速熒光壽命成像解決方案,使 FLIM 成像速度提升了近10倍(較經(jīng)典 TCSPC 方法),近共聚焦的成像的速度幾乎能滿足所有動(dòng)態(tài)過程的速度要求,可輕松實(shí)現(xiàn) XYZTλ 多方式快速熒光壽命成像

△ 視頻1. 對 Alexa Fluor 555 溶液中的熒光小球(品紅色)進(jìn)行快速熒光壽命成像。

使用FLIM比熒光強(qiáng)度(左)更有利分離目標(biāo)。單幀大?。?12 x 64 像素。比例尺:10 微米


同時(shí),該系統(tǒng)基于 Leica SP8 共聚焦成像平臺,可與白激光 STED 3X 納米顯微鏡、DIVE 多光子系統(tǒng)等相結(jié)合,形成基于一個(gè)平臺的 STED-FLIM、DIVE-FLIM 多模態(tài)成像。


參考文獻(xiàn):

1. Consuelo Anzilotti et.al., Nature Immunology, 2019 Vol 20 350-361, An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development.

2. Sean C Warren et.al., eLife, 2018 7:e35800, Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data. 

標(biāo)簽: FLIM-FRET 熒光壽命成像